谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是一类普遍存在的酶，这类酶用于催化谷胱甘肽与毒性生物异源物质或氧化产物结合，从而促进此类物质的代谢、区域化隔离或清除(Wilce and Parker, 1994; 王臻昱等, 2012)。经典的反应模式为，GSTs催化谷胱甘肽(γ-谷氨酰- 半胱氨酰-甘氨酸; GSH)转移到含有活性亲电中心的辅酶(R-X)上建立一个极性的S-谷胱甘肽反应产物(R-SG)。谷胱甘肽S-转移酶是一个庞大而多样的基因家族，根据氨基酸序列相似性将其分为tau、phi、zeta、theta、lambda和DHAR (谷胱甘肽依赖的抗坏血酸还原酶) 6个亚类，其中tau和phi两类GST在植物中含量最为丰富(Dixon et al., 2002; Jain et al., 2010)。GST基因序列同源性虽然较低(约为25%)，但通过对大量GSTs蛋白结构的研究发现(McGonigle et al., 2000; Thom et al., 2001)，这类蛋白具有高度保守的结构特征。

GST蛋白在多个代谢反应中起到重要作用。Edwards等(2000)发现玉米中GST蛋白能够催化谷胱甘肽与氯均三嗪阿特拉津结合，从而保护植物免受这类除草剂的伤害。Dalton等(2009)发现大豆根瘤中含有丰富的GSTs，研究表明根中GSTs对大豆根瘤的生物固氮有促进作用。除此之外，GST家族蛋白，也在植物抗击非生物胁迫反应中发挥积极作用。研究表明，谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)可通过降解胁迫条件下细胞内积累的毒性氧化物，从而保护植物免受氧化伤害(Sheehan et al., 2001; 王臻昱等, 2012)。已有大量研究表明GST转基因植物能够增强植物对逆境，如低温(Huang et al., 2009; 赵凤云等, 2006)、干旱(George et al., 2010)、盐碱(Ji et al., 2010)及重金属(Moons, 2003; 高可辉等, 2011)等的耐受能力。

大豆作为一种重要的农作物，对于提高其抗逆性改良品种有很高价值。虽然对于GSTs基因已有很多报道，但是在大豆对非生物逆境胁迫反应，具体是哪一个或是哪一类GSTs基因起着关键作用还不清楚。大豆基因组全序列信息和相关信息的注释和公布(http://www.phytozome.net/search.php?show=text& method=Org_Osativa/) (Schmutz et al., 2010)，使得在全基因组水平上运用生物信息学方法系统地分析大豆GST基因家族成为可能。本研究利用大豆全基因组数据和大豆基因芯片数据(http://www.soybase.org/)用生物信息学方法，筛选所有的GST基因家族，了该家族基因的染色体定位、分类、系统发育、启动子区的序列特征与转录谱变化值，为GST基因家族成员的功能研究及利用其提高农作物耐逆性提供参考。

1结果与分析
1.1大豆GST基因家族的筛选
 按照Phytozome大豆基因组数据库数据中的注释信息，并结合Pfam结构域分析，初步筛选出118个候选大豆GST基因，其中9个基因因不含完整开放读码框被排除；SMART结构域分析剔除了15个不含有或含有不完整GST结构域的基因，并结合McGonigle等(2000)对大豆GST家族的综合分析结果后最终得到94个大豆GST基因。大豆GST基因家族94个基因中蛋白等电点范围从4.75到10.22不等，其蛋白最短的有53个氨基酸残基，最长的有401个，跨度较大。

1.2大豆GST基因家族的序列和结构域分析
分析基因结构大豆GST家族基因，其具有的内含子较少(图1)，47个基因(约50.00%)含有1个内含子，26个基因(27.66%)含有2个内含子，只有4个基因(0.04%)不含有内含子，剩下18.10%的基因含有3~9个内含子。

图1 大豆GST蛋白序列的系统发生树 Figure 1 Phylogenetic tree showing relationship of all soybean GST protein sequences

利用Pfam和SMART在线工具分析结构域，结果表明(表1)，大豆GST家族蛋白至少有一个GST结构域(GST_N或GST_C)，有的存在两个结构域(GS- T_N和GST_C)，其中25个家族成员含有1个结构域(GST_N或GST_C)，其它成员均含有2个结构域。

 

表1 大豆GST基因的结构域及其启动子中ABRE, DRE, ERE, LTRE, MYB和MYC元件的数量分布 Table 1 Domain in GST genes and distribution of ABRE, DRE, ERE, LTRE, MYB, and MYC cis-acting elements in soybean GST gene promoters

1.3大豆GST基因家族的系统发育分析与分类
根据大豆GST基因家族的系统发育树(图1)，将大豆分为五个亚家族，即Tau、Phi、Lambda、Zeta和Theta类(图1)。对94个大豆GST家族蛋白和拟南芥GST家族蛋白，进行多重序列联配(ClustalX2软件)和系统进化分析(MEGA5.1软件)，结果显示拟南芥GST基因归属于除了Lambda亚家族类的其他四个亚家族(结果未显示)。

1.4大豆GST基因家族在染色体上的分布
根据GST家族的基因染色体定位信息，获得94个GST基因在大豆染色体上的分布图(MapInspect软件) (图2)。这些基因分布在16条大豆染色体上，其中第4、第9、第12和第16号染色体上不含有GST基因，第7号染色体还有的成员数量最多，有13个，第2、第8、第15和第18号染色体分布的成员数量较多，有9~11个，第19号染色体含有的成员数量最少，只有1个，其它各染色体含有3~6个GST基因。

图2 大豆GST基因的染色体分布 注: 基因组进化中旁系同源基因重复事件用直线连接表示 Figure 2 Chromosome distribution of GST genes in soybean genome Note: Genes related by endo-reduplication events during genome evolution (homologous genes) are connected by lines

将这94个大豆GST家族基因一一比对(DNAMAN软件)，并结合旁系同源基因的概念(Heikoff et al., 1997)和同源基因的判断标准(Yang et al., 2008)，发现了12对旁系同源基因(在图2中用虚线连接)。

1.5大豆GST基因家族启动子和组织表达分析
分析启动子结果(表1)显示，MYB元件和MYC元件在大豆GST基因家族启动子区中都存在，且数量总和最多，其归类于转录因子作用元件，主要作用是参与ABA应答或干旱的表达调控。此外，ABRE (ABA-responsive element)顺式作用元件在75个大豆GST基因家族成员(79.79%)启动子区中普遍存在；ERE (ethylene-responsive element)顺式作用元件在67个家族成员(71.28%)的启动区中都存在；LTRE (lowtemperature responsive element)顺式作用元件在50个家族成员(53.19%)的启动子区中存在；DRE (dehydra- tion-responsive element)顺式作用元件在27.66%的成员启动子区中存在。此结果表明GST基因家族与植物的非生物胁迫应答具有很大的联系(李乐等, 2011)。

GST转录谱组织表达分析运用Soybase数据库进行。结果表明，94个基因中有79个基因对应的14个不同组织和发育阶段的表达芯片数据，但其中有13个基因在其表达芯片数据中的值为0，所以只显示了66个基因的数据聚类结果(图3)。从各个组织的表达量(表达值单位是每百万转录本中基因的EST数, EST transcripts per million, TPM)上来讲，根中表达最多(1 018 TPM)，其次是花(916 TPM)，最少的是发育10 d的种子(219 TPM)。从基因来讲，Glyma08g41960和Glyma19g36080表达量总和最多(478 TPM)，其次是Glyma14g03470 (428 TPM)、Glyma08g18640 (373 TPM)和Glyma07g16910 (369 TPM)，其余基因的表达量都在300 TPM以下，最少的Glyma02g02860表达量只有1 TPM。大豆GST基因中有5个基因只在根中表达，包括Glyma02g02860 (Tau类)、Glyma05g29370 (Tau类)、Glyma05g37910 (Theta类)、Gm08g18660 (Tau类)和Glyma13g19130 (Tau类)。另外，有11个差异表达基因，其中，Glyma08g18640 (Tau类)在根瘤中优势表达，Glyma14g03470 (Phi类)、Glyma15g40280 (Tau类)和Glyma15g40290 (Tau类)这3个基因在花中优势表达，Glyma03g33340 (Lambda类)、Glyma06g20730 (Tau类)、Glyma07g16850 (Tau类)、Glyma07g16910 (Tau类)、Glyma08g12520 (Tau类)、Glyma10g33650 (Tau类)和Glyma18g13640(Phi类)这7个基因在根中的表达占有优势。

2讨论
分析大豆全基因组后，本研究共扫描筛选出94个大豆GST家族基因，分属于5个亚类(图1)。已知拟南芥包括48个GST基因(Wagner et al., 2002)，其中Tau和Phi类GSTs数量最多，分别是28和13个基因，而Theta类GSTs只有3个，Zeta和Lambda类GSTs分别只有2个。而由图1可知，大豆有63个Tau类，17个Phi类，8个Lambda类，3个Zeta类和3个Theta类GSTs。大豆Tau和Zeta类GSTs的丰度分布都与拟南芥类似，而大豆的Phi类GSTs比例相对小于拟南芥，大豆Lambda类GATs比例大于拟南芥。大豆中GST基因家族数目近乎于拟南芥的两倍，而分类却与拟南芥一样。

对启动子区的顺式作用元件分析中(表1)，所有GST基因家族都含有MYC和MYB这两种顺式作用元件，大部分家族成员含有ABRE、DRE、ERE和LTRE等顺式作用元件。外界非生物胁迫环境刺激应答调控的主要途径是ABA依赖型和非依赖型(向旭和傅家瑞, 1998; 龙海涛等, 2004)。在ABA依赖型和非依赖型调控机制中，ABRE、DRE、MYB和MYC等元件起重要的作用。在ABA依赖型中ABA诱导基因的顺式作用元件有ABRE、MYB、MYC等，该信号系统通过ABA合成MYB、MYC转录因子启动下游抗逆基因的表达(Abe et al., 1997; 2003; Agarwal et al., 2006)。在ABA非依赖型信号调控中，传感蛋白被信号激活后向DREB传递，再结合DRE顺式作用元件，下游抗逆基因即可被启动表达(Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; 李乐等, 2011; 郑炜君等, 2012)。同时，在植物逆境胁迫中，ABRE、DRE 和LTRE等顺势作用元件的作用也较重要。其中，ABRE诱导大量特异性蛋白，在ABA应答中，产生一些植物内调节作用(Nakashima et al., 2006; 李乐等, 2011)；DRE顺式作用元件结合DREB转录因子后在干旱、低温和高盐条件下调节下游一系列逆境应答基因的表达(Dubouzet et al., 2003; Qin et al., 2004; DiazMartin et al., 2005)，LTRE对ABA应答调节冷和干旱等逆境(Baker et al., 1994; Dunn et al., 1998)。对康乃馨GST1基因的研究发现ERE，即乙烯应答元件，在花瓣衰老调节中起作用(Itzhaki et al., 1994)。有研究，在应答外界非生物胁迫时，ABA依赖型与ABA非依赖型这2种调控机制相互交叉形成调控网络作用 ，而非彼此独立(Shinozaki and YamaguchiShinozaki, 2000)。此外，还发现了三个不含有ABRE、DRE、ERE和LTRE的基因，说明GST基因家族可能还存在有其它的调控机制。从表1中分析发现ABRE、ERE、LTRE、MYB和MYC等顺式作用元件在29个GST基因的启动子区都存在，其中在12个基因的启动子区中还含有DRE顺式作用元件。启动子分析指出大豆中GST基因家族基因在应答外界的非生物胁迫时可能是通过ABA依赖与非依赖型调控， 或是两者相互交联采用更精细的方式起到调控作用(郑炜君等, 2012)。

基因差异表达分析利用基因芯片表达数据进行，一共有11个GST基因差异表达。在根中特异表达的有7个基因，其中，Tau类有5个，Phi类和Lambda类分别有1个，说明GST 基因家族中至少3个亚家族对植物的根的发育有影响，且Tau类为主；另外在根瘤、花等部位优势表达的有4个基因中就有3个是Tau类，1个是Phi类，从而显示出该家族的基因表达具有多样性。但由于该表达数据库并没有包含所有GST基因家族的表达谱信息，所以分析结果可能具有一定的片面性，不全面。

对大豆全基因组数据(JGI Glyma1.1 annotation)进行鉴定与分析，一共筛选得到94个大豆GST家族基因成员，可将其分为5个亚家族(Tau, Phi, Lambda, Theta和Zeta类)，在16条染色体上均有分布，均至少有两个逆境反应顺式作用元件存在其启动子区中，其转录谱表达分析显示其有一定的组织特异性。

大豆GST基因在不同组织和生长发育阶段的表达强度分析，大多数GST基因在根部显著表达(图3)。66个具有表达值的基因中只有16个在根中不表达，这可能是由于根是植物的重要水分和矿物质营养的转运和吸收器官，在盐和干旱等胁迫后，根成为识别和受伤害的最主要的器官，能对逆境胁迫作出快速应答。已有文献证实一些根部GST基因在甘薯、柽柳等植物的胁迫耐受中诱导表达并行使功能(刘珣等, 2009; 杨桂燕等, 2011, http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201110-207/)，因此可以进一步推测大豆GST基因与逆境胁迫有关。尤其是Glyma02g02860 (Tau类)、Glyma05g29370 (Tau类)、Glyma05g37910 (Theta类)、Glyma08g18660 (Tau类)和Glyma13g19130 (Tau类)这5个基因仅在根中表达，暗示其有可能在遭受胁迫时起关键作用。另外，有实验表明GST基因与植物对除草剂的抗性相关(Karavangeli et al, 2005; 朱其松等, 2009)。有研究表明，除草剂乙草胺和阿特拉津对不同组织的诱导作用各不相同，乙草胺诱导玉米叶中GSTs活性小幅增加，抑制根中GSTs活性；阿特拉津诱导玉米根中GSTs活性增加，抑制叶中GSTs的活性(郭玉莲等, 2008)。Pascal等(2000)发现除草剂acifluorfen诱导的小麦GST主要在幼苗的地上组织表达，因此本研究中显示的在幼叶中高表达的Glyma01g04710和Glyma13g19840等基因可能在大豆对除草剂耐受上起重要作用。同时，本研究发现大多数GST基因在花中同样有表达，推测Glyma14g03470 (Phi类)、Glyma15g40280 (Tau类)和Glyma15g40290 (Tau类)这些在花中显著表达的基因可能参与大豆开花期的生长发育过程。总之，本实验通过结合多种数据资源，对大豆GST基因家族进行了系统的分析，并根据GST基因表达的组织特异性筛选出一些耐逆的候选基因，为大豆的品种改良和提高大豆对非生物胁迫的耐受性提供了理论基础。

图3 大豆GST 基因在不同组织和生长发育阶段的表达 注: 方块内颜色显示芯片表达热度: 红色最高, 其次为粉红, 白色, 浅蓝, 深蓝, 紫色, 其中紫色为0 Figure 3 Expression profile of soybean GST genes in different tissues and developmental stages Note: Colors in square presented heatmap scale of expression in chips: red is the highest, pink is higher, then is white, light blue, dark blue, and purple is zero

3材料与方法
3.1材料
从Phytozome网站(http://www.phytozome.net/ index.php/)大豆最新数据库版本JGI Glyma1.1 annotation中下载大豆(Glycine max)全基因组数据、相关信息和cDNA数据。从TAIR (Huala et al., 2001)网站(http://arabidopsis.org/)下载拟南芥GST家族的基因序列和蛋白序列。从Soybase网站(http://www.soybase.org/)下载大豆基因芯片数据。

3.2 GST基因家族成员筛选、结构域分析和基因结构分析
Phytozome网站中大豆基因组数据库(http://www. phytozome.net/index.php/)上的序列已经经过结构域等注释，直接搜索“glutathione S-transferas”即可获得具有GST结构域和预测的GST基因家族，下载获得每个基因序列的相关信息。使用Pfam数据库工具(Finn et al., 2010)，同时利用已经鉴定出的拟南芥中的GST基因家族成员的相关信息，获得其典型的结构域。再使用SMART在线网址(http://smart.emblheidelberg.de/) (Letunic et al., 2012)对其结构域进行进一步的分析，去除无典型的或不完整的GST结构域序列，并结合McGonigle等(2000)对大豆GST家族的综合分析结果，最终筛选获得大豆GST基因家族成员。这些基因的外显子-内含子结构图运用GSDS (郭安源等, 2007)在线网址(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制。

3.3 GST蛋白多序列比对和系统进化树的构建
多序列比对分析大豆和拟南芥GST蛋白利用的是Clustal X2程序，得到的序列比对结果使用MEGA5.1 (http://megasoftware.net/)下载程序采用邻接法(bootstrap值设置为500)生成GST基因家族的系统进化树(Tamura et al., 2011)。

3.4 GST家族基因的染色体定位
结合JGI Glyma 1.1 Annotation (大豆基因组最新数据版本)中基因在染色体中的信息，利用MapInspect本地软件，获得94个GST家族基因在染色体上的位置图。大豆GST家族基因中的重复片段分析利用DNAMAN软件，采用Yang等(2008)与Heikoff等(1997) 文献中提到的方法，判定其旁系同源基因，即在不同染色体上的2个基因的序列比对部分的长度要涵盖其较长序列的80%，并且其序列比对部分的相似性要大于70%，然后在染色体上标注分析结果。

3.5 GST家族基因的启动子区分析
启动子区设为大豆GST基因起始密码子上游2 000 bp的序列，从Phytozome大豆基因组数据库数据中获得其序列，主要通过PLACE 30.0(植物DNA顺式作用调控元件数据库)在线网站，并结合PlantCARE (植物顺式作用调控元件数据库)在线网站(郑炜君等, 2012)，分析这个家族成员启动子区的顺式作用元件。

3.6 GST基因的转录谱表达
从网站(http://www.soybase.org/)获得这94个基因在14个不同器官和生长发育阶段的基因芯片数据，其差异表达基因的分析利用Jain等(2007)的方法。运用在线网址(http://genepattern.broadinstitute.org/gp/pages/index.jsf?lsid=HierarchicalClustering/)对芯片表达数据进行数据聚类分析。

作者贡献
才华和江董丽是本研究的实验设计和实验研究的执行人；江董丽完成数据分析，论文初稿的写作；端木慧子参与试验结果分析和论文终稿的修改；朱延明和才华是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31171578)、国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08004002-002)和黑龙江省高校科技创新团队建设计划(2011TD005)共同资助。

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